Trong các vi khuẩn có khả năng hô hấp dưới các điều kiện sinh lý, ATP synthase nhìn chung hoạt động theo hướng ngược lại, dùng để sản sinh ATP bằng cách sử dụng lực vận động proton tạo bởi chuỗi chuyển điện tử như là một nguồn năng lượng. Quá trình tạo năng lượng như thế này được gọi là sự phosphorylate ôxi hóa. Một quá trình tương tự xảy ra trong ti thể, nơi ATP synthase có mặt tại màng trong của nó (phần F1 hướng về chất nền, nơi diễn ra sự tổng hợp ATP). Vai trò và sự hoạt động của ti thể trong các sinh vật nhân chuẩn giúp tế bào giữ được hàm lượng ATP cao gấp 10 lần ADP và nhờ đó giữ được phản ứng thủy phân ATP luôn xảy ra theo chiều thuận.[12]

Giống như các enzyme khác, hoạt tính của F1FO và ATP synthase mang tính thuận nghịch, hoán chuyển giữa thế điện hóa proton và năng lượng trong các liên kết hóa học. Phản ứng xảy ra theo chiều tổng hợp hay thủy phân ATP phụ thuộc vào sự cân bằng giữa năng lượng độ dốc của thế điện hóa proton (Gp, với giá trị luôn âm) và sự chênh lệch giữa năng lượng tự do Gibbs (ΔG, với giá trị luôn dương) trong phản ứng thủy phân ATP; sự cân bằng của hai giá trị này xảy ra khi Gp + ΔG = 0. Gp tỉ lệ trực tiếp với giá trị của lực vận động proton xuyên qua màng ti thể, còn ΔG tùy thuộc vào tỉ lệ của ATP với ADP và Pi[13] Cụ thể, Gp + ΔG < 0, ATP synthase sẽ đóng vai trò sản sinh ATP nhằm thay đổi tỉ lệ ATP với ADP và Pi. Tương tự nếu Gp + ΔG > 0, ATP synthase sẽ thủy phân ATP để bơm thêm proton nhằm tăng cường sự chênh lệch thế điện hóa.

Tương tự, ở vi khuẩn ATP synthase cũng có tác dụng hoán chuyển giữa biến dưỡng hiếu khí và kị khí.[13] Ở đây, một lượng ATP sythase vừa đủ lớn có thể giúp tạo ra một thế proton điện hóa được dùng bởi các vi khuẩn lên men vốn không có chuỗi chuyển điện tử, và thủy phân ATP để tạo ra một thế proton dùng để quay các tiên mao[14] hay vận chuyển các chất dinh dưỡng trong tế bào.